淺述熒光定量PCR試劑盒的操作方法
點(diǎn)擊次數(shù)：773 更新時間：2021-03-10
一、病毒DNA的提取
1、取出已處理的樣品、陰性對照和陽性對照，分別加入600/L抽提液（用抽提液之前不要晃動，不要吸到上層保護(hù)液），用力顛倒10次混勻，12,000rpm離心10min。
2、取500/L上清置于滅菌離心管中，加入500/L異丙醇，混勻，置液氮中3min或-70℃冰箱中30min。取出樣品管，室溫融化，13,000rpm離心15min。
3、棄上清，沿管壁緩緩加入1mL洗滌液，輕輕旋轉(zhuǎn)一周后倒掉，將離心管倒扣于吸水紙上1min，再將離心管真空抽干15min或37℃烘干。
4、用30/L無菌水溶解沉淀，作為模板備用。
二、樣品制備
1、樣品采集：病死或撲殺的豬，取大腦海馬背側(cè)皮層、中腦、腦橋、扁桃體、淋巴結(jié)等組織；待檢活豬，用棉拭子取鼻腔分泌物，置于50%甘油生理鹽水中，或用注射器取血5mL，2～8℃保存。（要求送檢病料新鮮，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。）
2、樣品處理：
?。?）組織樣品的處理：稱取組織0.1g于研磨器中磨碎，再加1mL生理鹽水繼續(xù)磨至無塊狀物；然后將樣品轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心5min，取上清100/L于1.5mL滅菌離心管中，加入500/L裂解液和10/L蛋白酶K，混勻后37℃溫育1h。
?。?）全血樣品的處理：待血凝后取血清放于離心管中，8000rpm離心5min，取上清100/L于1.5mL滅菌離心管中，加入500/L裂解液和10/L蛋白酶K，混勻后37℃溫育1h。
?。?）陽性對照的處理：混勻后取100/L于1.5mL滅菌離心管中，加入500/L裂解液和10/L蛋白酶K，混勻后37℃溫育1h。
（4）陰性對照的處理：混勻后取100/L于1.5mL滅菌離心管中，加入500/L裂解液和10/L蛋白酶K，混勻后37℃溫育1h。
三、PCR
1、反應(yīng)體系：分別取16/LPCR反應(yīng)液A（用前混勻）、2/LPCR反應(yīng)液B（用前混勻）和2/L模板DNA，混勻。
2、反應(yīng)程序：在PCR儀上運(yùn)行以下程序：94℃3min；94℃30s、55℃30s、72℃30s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。
四、電泳
1、制膠：用50倍稀釋的TAE電泳緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠。
2、電泳：待膠凝固后，取5/LPCR擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠孔中，以5V/cm的電壓于50倍稀釋的TAE電泳緩沖液中電泳。
3、染色：取50倍稀釋的TAE電泳緩沖液30mL，加入10/L染色液，混勻后將膠浸泡30min，于紫外燈下觀察結(jié)果。
